Российский медико-биологический вестник имени академика И.П.Павлова, No1, 2006 г.25 © ЯцюкВ.Я., ЧалыйГ.А., СошниковаО.В. 2006 УДК 615.322 Я 949
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ТРАВЫ КРАПИВЫ ДВУДОМНОЙ
В.
Я. Яцюк, Г.А. Чалый, О.В. Сошникова Курскийгосударственныймедицинскийуниверситет.
Установлен качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ травы крапивы двудомной. Впервые изучен аминокислотный состав, моносахаридный набор ПСКиПВ, выявлено присутствие 4 макро- и 18 микроэлементов, определено их количественное содержание. Изучение содержания состава травы крапивы двудомной методом ВЭЖХ показало, присутствие в сырье помимо ранее описанных галловой, кофейной кислот, рутина и кверцетина также гиперозида, лютеолин – 7 – гликозида, 3,4-изорамнетинадигликозида, хлорогеновой кислоты. В первые определено суммарное содержание водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, дубильных веществ, пигментов (каротиноидов и хлорофиллов), витамина К1, тритерпеновых соединений и сапонинов тритерпенового типа.
Официальным видом сырья является лист крапивы двудомной. С целью рационального использования сырья и оптимизации заготовки, целесообразно изучить возможность использования травы крапивы двудомной. В литературе приводятся сведения о том, что трава крапивы двудомной содержит некоторые одно- и двухосновные карбоновые кислоты (муравьиную, масляную, щавелевую, янтарную, фумаровую), некоторые окси-кислоты (молочную, лимонную, хинную, галловую). Содержание суммы органических кислот в пересчете на малат составляет 18,2±0,39%. В траве присутствует аминокислоты, азотсодер-жащие соединения, эфирное масло в том числе метил гептенон, ацетофенон; стероиды – ситостерин; витамины: В1, В2, С, Е, К, РР, каротин; дубильные вещества, флавоноиды; кумарины, а также порфирины – протопорфирин, копропорфирин I; тритерпеновые вещества и лигнаны [12, 6]. Кавторадзе Н.Ш. ссоавт. (2001) [6] из надземной части крапивы двудом-ной выделили кофейную кислоту, рутин, кверцетин, гиперин, изокверцетин. Однако, в доступной нам научной литературе не приводятся в полном объеме сведения о качественном составе и количественном соотношении в данном виде сырья веществ первичного и вторичного синтеза. Всвязи с этим детальное исследование основных классов биологическиактивных веществ травы крапивы дву-домной является актуальным, что и послужило целью наших исследований.
Материал и методы
Для анализа использовали воздушно сухое сырье заготовленное в 2003-2004 гг. на территории Курской области. Наличие аминокислот определяли в водном извлечении нингидриновой пробой, по появлению красно-фиолетового окрашивания, усиливающегося при охлаждении. Хроматографическое определение аминокислот в очищенном водном из-влечении проводили на пластинках «Silufol» в системах растворителей н-бутанол уксусная кислота ледяная – вода (4:1:2), (12:3:5), н-бутанол-диэтиловый эфир-уксусная кислота ле-дяная – вода (9:6:3:1), н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3). Хроматографиче-ские пластинки обрабатывали 0,2% рас-твором нингидрина в ацетоне, нагрева-ли в сушильном шкафу при температуре105°С в течение 2-3 минут. Аминокис-лоты в видимом свете визуализирова-лись в виде розово-пурпурных пятен.
Количественное содержание аминокислот в траве крапивы двудомной проводили на аминокислотном анализаторе ААА-339 (ЧССР), в стандартных условиях, используемых обычно для разделения белковых гидролизатов [14]. В качестве внутреннего стабилизатора использовали смесь, состоящую из 12 аминокислот. Количественную оценку осуществлял и автоматически площади пиков удержания идентифицированных аминокислот. Часть исследований была посвящена исследованию элементного состава крапивы двудомной. Элементный со-став определяли при помощи спектрального анализа. Анализируемые образцы высушивали, измельчали и подвергали озолению в муфельной печи при температуре 450 ̊С–500 ̊С. Полу-ченную золу анализировали при помощи спектрографа PegS (Германия). Фо-тометрирование спектрограмм проводили на спектропроекторе ДФС-8-1. Для определения отдельных элементов использовали атлас спектральных линий и спектров стандартов. [1].
В траве крапивы двудомной качественными реакциями и хроматографически было установлено присутствие моно- и полисахаридов. Определение содержания водорас-творимого полисахаридного комплекса (ВПСК), в траве крапивы двудомной проводили гравиметрическим методом, основанном на осаждении полисахари-дов из водного извлечения 96% этано-лом, с последующим взвешиванием сухого остатка [5,11]. Пектиновые веще-ства (ПВ) извлекали из шрота, оставшегося после получения ВПСК, смесью 0,5% растворов щавелевой кислоты и оксалата аммония в соотношении 1:1, в течении 2,5часов. Осаждали пятикратным объемом 96% этилового спирта. Идентификацию и количественное определение моносахаридов, входящих в состав ВПСК, осуществляли после 8 гидролиза 2нсерной кислотой, ПВ, после 24 кислотного гидролиза.
Идентификацию моносахаридов проводили методом хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента. Нейтральные моносахара хроматографировали в системах растворителей этилацетат-пиридин-вода (12:5:4), н-бутонол – уксусная кислота – вода (3:1:1), н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3), кислые в системе этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (8:3:1:4). После разделения сахаров хроматограммы обрабатывали анилинфталатным реак-тивом, сахара проявлялись в виде пятен красно-коричневой окраски. Качественный состав органических кислот в травекрапивы двудомной оп-ределяли методом тонкослойной хрома-тографии в системе растворителей (спиртэтиловый 95% – аммиак концен-трированный (16:4,5)). Органические кислоты на хроматограммах обнаруживали с использованием достоверных образцов после обработки раствором бром кризолового зеленого пожелтым пятнам на зеленомфоне. Количественное определение сум-мы свободных органических кислот и аскорбиновой кислоты проводили титрометрическими методамипо ГФ XI [4]. Количественное определение дубильных веществ приводили с использова-нием фармакопейной методики (ГФXI) – перманганатометрии [3]. Фенольный состав травы крапивы двудомной изучен методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на ру-тин осуществляли спектрофотометрическим методом [2]. Пигменты качественно определяли в ацетоновом извлечении с помощью тонкослойной, мономерной хроматографии восходящим способом на пла-стинках «Силуфол», в различных системах растворителей: хлороформ – эта-нол (9:1), бензол – этанол (8:2). Пятна на хроматограммах обнаруживали по флюоресценции вУФ-свете и визуально. Количественное определение осу-ществляли методом спектрофотометрии позволяющим определять каротиноиды и хлорофиллы при их совместном присутствии. [9]. Наличие стероидных соединений устанавливали качественными реакция-мии хроматографически, методомТСХ в системах растворителей: петролейныйэфир – бензол – этанол (60:10:1); гексан– ацетон (8:2); хлороформ – этанол(95:5). В качестве проявителей исполь-зовали раствор треххлористой сурьмы, реактив Шталя. Тритерпеновые соеди-нения хроматографировали в системе растворителей бензол-ацетон (8:1); хло-роформ – ацетон (4:1); бутанол-ацетон-вода (4:5:1), с последующим проявлени-ем 20% спиртовым раствором фосфор-но-вольфрамовой кислоты. Количественное содержание тритерпеновых со-единений проводили гравиметрическим методом [11]. Содержание тритерпеновых сапонинов в траве крапивы дву-домной определяли фотоколориметрически. Содержание витамина К1 уста-навливали хроматоспектрофотометрическим методом предложенным Кавта-радзеН.Ш. [7].
Результаты и их обсуждение
Результаты исследований количественного состава травы крапивы двудомной показали наличие в ней различных групп биологически активных веществ, приведенных в таблице 1. Таблица 1 Содержание биологически активных веществ в траве крапивы двудомной
Название БАВ Содержание БАВ
Аминокислоты, % 1,83±0,04 Полисахариды (водорастворимые), % 6,80±0,17 Пектиновыевещества, % 16,69±0,61 Органическиекислоты, % 8,30±0,17 Аскорбиноваякислота, % 0,14±0,002 Дубильныевещества, % 3,22±0,05
Флавоноиды, % 1,55±0,05 Хлорофиллы, мг/100г 211,30±6,89 Каротиноиды, мг/100г 108,00±1,09 Тритерпеновыесоединения, % 0,97±0,04 Тритерпеновыесапонины, % 0,09±0,003 ВитаминК1, мг% 218,63±8,46
Качественный и количественный аминокислотный анализ травы крапивы двудомной показал, что содержание таких аминокислот как треонинисерин составляет 43% от суммарного содержание аминокислот, аланина 10%, ли-зина 14%, гистидина 10%, аспарагино-войкислоты 5%,
таблица 2.
Содержание свободных и связанных аминокислот в траве крапивы двудомной, мг% (мкг/мг)
| Аминокислота |
свободные |
связанные |
Аминокислота |
свободные |
связанные |
| Аспарагиновая |
1,754 |
35,865 |
Лейцин* |
1,456 |
3,157 |
| Треонин*+серин |
16,526 |
28,635 |
Фенилаланин* |
2,420 |
2,828 |
| Глутаминовая |
0,190 |
16,415 |
Лизин* |
5,518 |
4,175 |
| Глицин |
0,246 |
3,245 |
Гистидин* |
3,980 |
19,335 |
| Аланин |
3,770 |
13,370 |
Аргенин |
1,194 |
23,856 |
| Валин |
1,009 |
1,239 |
Тирозин |
0,411 |
1,913 |
| |
Сумма |
38,474 |
154,09 |
Примечание: * – незаменимая аминокислота
В результате проведенных исследований в траве крапивы двудомной обнаружены макро — (K – 1,0%, Ca – 1,0%, P – 0,3%, Na – 0,01%) и микро-элементы (Mg – 0,5%, Fe – 0,1%, B – 0,003%, Al – 0,05%, Si – 0,5%, Cu – 0,001%, Zn – 0,003%, Pb – 0,0006%, Ag – 0,1·10-4%, Mo – 0,1·10-3%, Ba – 0,02%, Sr – 0,03%, Mn – 0,06%, Ni – 0,1·10-3%, Ti – 0,02%, V – 0,1·10-3%, Cr – 0,6·10-3%, Zr – 0,5·10-3%).
Методом тонкослойной хромато-графии в системе растворителей изо-пропанол-вода (4:1), установлено присутствие альдоз (глюкозы, галактозы, рамнозы, сахарозы), кетозы в траве крапивы двудомной не обнаружены. В составе ПСК травы крапивы двудомной обнаружили 5 веществ нейтрального характера: арабинозу, рамнозу, глюкозу, галактозу и фруктозу, а также веществ окислого характера – глюкуроновую кислоту. ПВ содержат 5 веществ ней-трального характера: глюкозу, арабинозу, рамнозу, фруктозу, мальтозу и вещество кислого характера – глюкуроновую кислоту. Установлено присутствие 6 органических кислот, пять из которых идентифицировано с достоверными образцами как щавелевая, аскорбиновая, молочная, янтарная, яблочная; выявлено4 веществ атритерпеновой и 6 стероидной природы; б-, в- и г-каротиноидов, дубильных веществ конденсированно готипа. Фенольный состав травыкрапивы двудомнойпредставлен 42 веществами, из них идентифицированы галловая(0,0034%), кофейная (0,0057%), хлоро-геноваякислоты (0,3092%), гиперозид (0,0092%), кверцетин (0,0069), лютео-лина-7-гликозид (0,082%) рутин(0,3678%), 3,4,-изорамнетинадиглико-зид (0,1540%), эскулетин (0,7977%).
Заключение
Установлен качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ травы крапивы двудомной. В первые изучен аминокислотный состав, моносахаридный набор ПСКиПВ, выявлено присутствие 4 макро- и 18 микроэлементов, определе-но их количественное содержание. Изучение фенольного состава травы крапи-вы двудомной методом ВЭЖХ показа-ло, присутствие в сырье помимо ранее описанных галловой, кофейной кислот, рутина и кверцетина также гиперозида, лютеолин-7-гликозида, 3,4-изорамнети-надигликозида, хлорогеновой кислоты, эскулетина. Впервые определено сум-марное содержание водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, дубильных веществ, пигментов (каро-тиноидов и хлорофиллов), витаминаК1, тритерпеновых соединений и сапонинов тритерпенового типа.
ЛИТЕРАТУРА 1. Атлас спектральных линий для кварцевого спектрографа: [Текст]/ С.А. Кали-нин [идр.] – М., 1959, – 53с
2. Барковский В.Ф. Дифференциальный спектрофотометрический анализ[Текст] / В.Ф. Барковский, В.И. Гана-польский // М., 1989. – 245с.
3. Государственная фармакопея СССР: Вып .1. Общие методы анализа. / МЗСССР[Текст]. – 11– еизд., доп.– М.: Медицина, 1987.– 336с.
4. Государственная фармакопея СССР: Вып .2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье/ МЗСССР[Текст]. – 11– еизд., доп.– М.: Медицина, 1989.– 400с. 5. Дорогойченков, В.Н. Количественное определение восстанавливающих моно-сахаридов в водорастворимом полисахаридном комплексе из цветков липы сердцевидной [Текст] / В.Н. Дорогойченков, В.Н. Чушенко // Фармация. – 1988.– т.37, No 9. – С. 39– 40. 6. Кавторадзе Н.Ш. Химические компоненты Urtica dioica, произростающей в Грузии: [Текст] / Н.Ш. Кавторадзе, М.Д. Алания, Дж.Н. Анели // Химия природных соединений.- 2001. – No3. – С.244.
7. Кавтарадзе, Н.Ш. Хроматоспектрофотометрический метод определения витамина К1влистьяхUrtica dioica L:[Текст] / Н.Ш. Кавтарадзе, М.Д. Алания// Растительные ресурсы., 2002.– Т.38, вып.4. – С. 118–120
8. Лебедев, А.В. Аминокислотный состав зверобоя четырехгранного [Текст]/ А.В. Лебедев // Современные проблемы фармакогнозии и фитотерапии: межвуз. сб. науч. трудов, посвящ. 15– летиюкаф. фармакогнозииЯГМА. – Яро-славль: ЯГТУ, 1999. – С. 21– 22.
9.Литвиненко В.И. Количественное опре-деление каротиноидов и хлорофиллов хладонового экстракта валерианы лекарственной [Текст]/ В.И. Литвиненко, С.В. Талашова, Т.П. Попова//Состояниеиперспективысовременно-голекарствоведения. – Ярославль, 1997. – С.65– 66
10. НиколаеваН.А. Влияние препаратов крапивы на морфолого-функциональное состояние слизистой желудка: [Текст] / // авторефдисс… канд. биол. наук. Н.А. Николаева – Улан-Удэ, 1997. – 20с.
11. Растительные лекарственные средства: [Текст] / под. ред. проф. Н.П. Максюти-ной,- Киев.; Здоров,я. – 1985. – 280с
12. Растительные ресурсы СССР: Цветко-выерастения, иххимическийсостав, использование; Семейства Magno-liaceae– Limoniaceae [Текст]/ [редкол.: П.Д. Соколов (гл.ред.) идр.] .– Л.: Нау-ка,1984– 460 с.
13. Яцюк, В.Я. Исследование аминокислотного состава растений рода крапива [Текст] / В.Я. Яцюк [идр.] / /Разработка, исследование и маркетингновой фармацевтической продукции: сборникнаучныхтруд./ (ПГФА). – Пя-тигорск, 2005. – вып. 60.- С.75-76.
